Arrimaha faragelinta ee falcelinta PCR

Inta lagu jiro falcelinta PCR, waxaa badanaa la kulmaa arrimo faragelin ah.
Sababtoo ah xasaasiyadda sare ee PCR, wasakhowga waxaa loo arkaa mid ka mid ah arrimaha ugu muhiimsan ee saameeya natiijooyinka PCR waxayna keeni karaan natiijooyin been abuur ah oo togan.
Sidoo kale waxaa muhiim ah ilaha kala duwan ee keena natiijooyin been abuur ah. Haddii hal ama in ka badan oo ka mid ah qaybaha muhiimka ah ee isku darka PCR ama falcelinta kor u qaadista lafteeda la joojiyo ama la farageliyo, baaritaanka ogaanshaha waa la carqaladeyn karaa. Tani waxay horseedi kartaa hoos u dhac ku yimaada waxtarka iyo xitaa natiijooyin xun oo been abuur ah.
Marka laga soo tago joojinta, luminta daacadnimada nucleic acid ee bartilmaameedka ah ayaa dhici karta sababtoo ah xaaladaha rarista iyo/ama kaydinta ka hor diyaarinta muunadda. Gaar ahaan, heerkulka sare ama kaydinta aan ku filnayn waxay keeni kartaa dhaawac unugyada iyo asiidhyada nucleic. Hagaajinta unugyada iyo unugyada iyo ku-xidhnaanta paraffin waa sababaha caanka ah ee kala-goynta DNA-da iyo dhibaato joogto ah (fiiri Jaantusyada 1 iyo 2). Xaaladahan, xitaa go'doominta iyo nadiifinta ugu fiican ma caawin doonaan.

Jaantuska 1 | Saamaynta joojinta dhaqdhaqaaqa ee ku aaddan hufnaanta DNA-da
Elektroforesis-ka jel ee Agarose wuxuu muujiyay in tayada DNA-da laga soocay qaybaha paraffin ee baaritaanka meydadka ay aad u kala duwanaayeen. DNA-da oo dhererkeedu kala duwan yahay ayaa ku jirtay soosaarka iyadoo ku xiran habka hagaajinta. DNA-da waxaa la keydiyay oo keliya marka lagu dhejiyo muunado la qaboojiyey oo ku jira formalin dhexdhexaad ah oo la buffered. Isticmaalka formalin oo aashito leh oo Bouin ah ama aan buffered ahayn, oo leh aashito formic ah ayaa keentay lumitaan weyn oo DNA ah. Jajabka soo haray aad ayuu u kala qaybsan yahay.
Dhinaca bidix, dhererka jajabyada waxaa lagu muujiyaa lammaane kilobase ah (kbp)

Jaantuska 2 | Lumitaanka hufnaanta bartilmaameedyada aashitada nukliyeer
(a) Farqiga 3′-5′ ee labada xarig wuxuu keeni doonaa jab ku yimaada DNA-da bartilmaameedka ah. Isku-darka DNA-da ayaa wali ka dhici doona jajabka yar. Si kastaba ha ahaatee, haddii goob lagu buufiyo oo ka maqan qaybta DNA-da, waxaa dhacda oo keliya ballaarin toosan. Xaaladda ugu wanaagsan, jajabku wuu is buuxin karaa, laakiin wax-soo-saarku wuxuu noqon doonaa mid yar oo ka hooseeya heerarka ogaanshaha.
(b) Lumitaanka saldhigyada, oo inta badan ay ugu wacan tahay depurination iyo sameynta thymidine dimer, waxay horseeddaa hoos u dhac ku yimaada tirada H-bonds iyo hoos u dhaca Tm. Inta lagu jiro marxaladda diirimaadka ee dheer, primers-ku waxay ka dhalaali doonaan DNA-da matrix-ka mana ku daadan doonaan xitaa xaalado aan adagayn.
(c) Saldhigyada thymine ee ku xiga waxay sameeyaan TT dimer.
Dhibaato kale oo caadi ah oo inta badan ka dhacda baaritaanka unugyada waa sii deynta aan fiicnayn ee asiidhyada nucleic-ga bartilmaameedka ah marka la barbar dhigo soo saarista phenol-chloroform. Xaaladaha daran, tani waxaa lala xiriirin karaa taban been ah. Waqti badan ayaa lagu badbaadin karaa iyadoo la karkariyo lysis ama dheefshiidka enzymatic ee haraaga unugyada, laakiin habkani wuxuu inta badan keenaa xasaasiyadda PCR oo hooseysa sababtoo ah sii deynta nucleic acid oo aan ku filnayn.

Joojinta dhaqdhaqaaqa polymerase inta lagu jiro kordhinta

Guud ahaan, joojinta waxaa loo isticmaalaa fikrad weel ahaan si loo sharaxo dhammaan arrimaha keena natiijooyinka PCR ee aan fiicnayn. Marka la eego macnaha kiimikada ee adag, joojinta waxay ku kooban tahay dhaqdhaqaaqa ensaymka, tusaale ahaan, waxay yareysaa ama ka hortagtaa beddelka badeecada substrate-ka iyada oo loo marayo isdhexgalka goobta firfircoon ee DNA polymerase ama cofactor-keeda (tusaale ahaan, Mg2+ ee Taq DNA polymerase).
Qaybaha ku jira muunadda ama kaydiyayaal kala duwan iyo soosaarayaal ka kooban reagents ayaa si toos ah u joojin kara ensaymka ama dabooli kara cofactors-kiisa (tusaale ahaan EDTA), taasoo joojinaysa polymerase-ka oo iyaduna horseedaysa natiijooyin PCR oo taban oo yaraaday ama been abuur ah.
Si kastaba ha ahaatee, isdhexgal badan oo u dhexeeya qaybaha falgalka iyo asiidhyada nucleic-ka ee bartilmaameedka ku jira ayaa sidoo kale loo yaqaan 'PCR inhibitors'. Marka hufnaanta unugga ay carqaladeyso go'doominta oo asiidhka nucleic-ga la sii daayo, isdhexgalka ka dhexeeya muunadda iyo xalka ku xeeran iyo marxaladda adag ayaa dhici karta. Tusaale ahaan, 'scavengers' waxay ku xidhi karaan DNA-da hal-ama laba-xadhig leh iyada oo loo marayo isdhexgalka aan isku xidhnayn waxayna faragelin karaan go'doominta iyo nadiifinta iyagoo yareynaya tirada bartilmaameedyada ugu dambeyntii gaara weelka falgalka PCR.
Guud ahaan, PCR-ga ayaa ku jira inta badan dareerayaasha jirka iyo walxaha loo isticmaalo baaritaannada ogaanshaha kiliinikada (urea ee kaadida, hemoglobin iyo heparin ee dhiigga ku jira), kaabisyada cuntada (qaybaha dabiiciga ah, glycogen, dufanka, Ca2+ ions) iyo qaybaha deegaanka (phenols, biraha culus)

Daawooyinka PCR ee aadka u badan waxaa laga heli karaa bakteeriyada iyo unugyada eukaryotic, DNA-da aan bartilmaameedka ahayn, macromolecules-ka DNA-da ee unugyada unugyada iyo qalabka shaybaarka sida galoofyada iyo balaastikada. Nadiifinta asiidhyada nucleic inta lagu jiro ama ka dib soo saarista ayaa ah habka ugu wanaagsan ee looga saari karo daawooyinka PCR-ga.
Maanta, qalab kala duwan oo soo saarista otomaatiga ah ayaa beddeli kara hab-raacyo badan oo gacanta lagu sameeyo, laakiin 100% soo kabashada iyo/ama nadiifinta bartilmaameedyada weligeed lama gaarin. Ka-hortagga suurtagalka ah ayaa wali ku jiri kara asiidhyada nucleic-ga ee la nadiifiyey ama laga yaabo inay horey u dhaqan galeen. Istaraatiijiyado kala duwan ayaa jira si loo yareeyo saameynta ka-hortagga. Doorashada polymerase-ka ku habboon waxay yeelan kartaa saameyn weyn oo ku saabsan dhaqdhaqaaqa ka-hortagga. Hababka kale ee la xaqiijiyay si loo yareeyo ka-hortagga PCR waa kordhinta fiirsashada polymerase ama ku-darka waxyaabaha lagu daro sida BSA.
Joojinta falcelinta PCR waxaa lagu muujin karaa isticmaalka xakamaynta tayada habka gudaha (IPC).
Waa in taxaddar la muujiyaa si looga saaro dhammaan walxaha firfircoon iyo xalalka kale ee ku jira qalabka soo saarista, sida ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol iyo phenol, laga soocay aashitada nucleic-ga iyadoo la adeegsanayo tallaabo dhaqid oo dhammaystiran. Iyadoo ku xiran xoogga ay leeyihiin, waxay kicin karaan ama joojin karaan PCR.