Qodobbada faragelinta ee falcelinta PCR

Inta lagu jiro falcelinta PCR, waxaa badanaa la kulma arrimo faragelinaya.
Dareenka PCR ee aadka u sarreeya awgeed, wasakheynta waxaa loo tixgeliyaa inay tahay mid ka mid ah arrimaha ugu muhiimsan ee saameeya natiijooyinka PCR waxayna soo saari kartaa natiijooyin been abuur ah.
Sidoo kale muhiim ayaa ah ilaha kala duwan ee keena natiijooyin been abuur ah. Haddii hal ama ka badan oo qayb muhiim ah oo ka mid ah isku dhafka PCR ama falcelinta xoojinta lafteeda la joojiyo ama la farageliyo, baaritaanka ogaanshaha waa la hor istaagi karaa. Tani waxay horseedi kartaa hoos u dhac ku yimaada waxtarka iyo xitaa natiijooyin xun oo been ah.
Ka-hortagga ka sokow, luminta daacadnimada aashitada nucleic-ka ah ayaa laga yaabaa inay dhacdo sababtoo ah maraakiibta iyo/ama xaaladaha kaydinta kahor diyaarinta muunada. Gaar ahaan, heerkulka sare ama kaydinta aan ku filnayn waxay u horseedi kartaa dhaawaca unugyada iyo asiidhka nucleic. Qalabaynta unugga iyo unugga iyo isku-xidhka paraffin waa sababaha caanka ah ee kala-goynta DNA-da iyo dhibaato joogto ah (eeg jaantusyada 1 iyo 2). Xaaladahan, xitaa go'doominta ugu fiican iyo nadiifinta ma caawin doonto.

Sawirka 1 | Saamaynta dhaqdhaqaaq-la'aantu ku leedahay daacadnimada DNA-da
Agarose gel electrophoresis waxay muujisay in tayada DNA-da ee ka go'doonsan qaybaha paraffin ee baaritaanka meydka ay si aad ah u kala duwan tahay. DNA-da celceliska dhererka jajabka kala duwan ayaa ku jiray soosaarayaasha iyadoo ku xiran habka hagaajinta. DNA-da waxa la xafiday oo kaliya marka lagu hagaajiyo muunado la qaboojiyey oo asal ahaan ka soo jeeda iyo qaab dhexdhexaad ah. Isticmaalka aashitada adag ee Bouin fixative ama unbuffered, formic acid-ka ku jira formalin waxay keentay luminta DNA-da weyn. Jajabka soo hadhay aad buu u kala qaybsan yahay.
Dhanka bidix, dhererka jajabyada waxaa lagu muujiyay lammaane kilobase (kbp)

Sawirka 2 | Luminta daacadnimada bartilmaameedyada nucleic acid
(a) Farqiga 3′-5′ ee labada xadhigba waxay keeni doontaa jebinta DNA-da bartilmaameedka ah. isku dhafka DNA-da ayaa wali ku dhici doona jajabka yar. Si kastaba ha ahaatee, haddii goobta xididdada asaasiga ah ay ka maqan tahay jajabka DNA-da, kaliya kordhinta toosan ayaa dhacda. Xaaladda ugu wanaagsan, jajabyada ayaa laga yaabaa inay midba midka kale dib u soo celiso, laakiin wax soo saarku wuxuu noqon doonaa mid yar oo ka hooseeya heerarka ogaanshaha.
(b) Luminta saldhigyada, inta badan ay sabab u tahay depurination iyo sameynta dimer thymidine, waxay keenaysaa hoos u dhaca tirada H-bonds iyo hoos u dhaca Tm. Inta lagu jiro marxaladda kulaylka ee la dheereeyey, aasaasayaashu waxay ka dhalaali doonaan DNA-da matrixka oo ma tirtiri doonaan xitaa xaalado adag.
(c) Saldhigyada thymine ee ku xiga waxay sameeyaan dimer TT.
Dhibaato kale oo caadi ah oo inta badan ku dhacda ogaanshaha molecular waa sii-deynta ka yar ee ugu fiicneyn ee asiidhyada nucleic-ka ah marka la barbar dhigo soo saarista phenol-chloroform. Xaaladaha ba'an, tani waxay la xiriiri kartaa diidmo been ah. Waqti badan ayaa lagu badbaadin karaa iyadoo la karkariyo lysis ama dheefshiidka enzymatic ee qashinka unugyada, laakiin habkani wuxuu badanaa keenaa dareenka PCR hooseeya sababtoo ah sii deynta nucleic acid ku filan.

Joojinta dhaqdhaqaaqa polymerase inta lagu jiro xoojinta

Guud ahaan, ka-hortagga waxaa loo isticmaalaa fikradda weel si loo qeexo dhammaan qodobbada keena natiijooyinka PCR-ga hoose. Dareenka bayoolaji ee adag, ka-hortagga waxa ay ku kooban tahay hawsha ensaymka, ie, waxa ay yaraynaysaa ama ka hortagtaa beddelka badeecada substrate-ka iyada oo la falgasha goobta firfircoon ee DNA-da polymerase ama cofactor-keeda (tusaale, Mg2+ ee Taq DNA polymerase).
Qaybaha ku jira muunada ama kaydiyayaal kala duwan iyo soosaarayaal ay ku jiraan reagents ayaa si toos ah u joojin kara enzyme-ka ama dabinka wada-hawlgalayaasheeda (tusaale EDTA), si ay u hawlgeliso polymerase oo ay iyaduna horseeddo natiijooyin xun oo PCR ah.
Si kastaba ha ahaatee, isdhexgalka badan ee ka dhexeeya qaybaha falcelinta iyo asiidhyada nukliyeerka ku jira ee bartilmaameedka ah ayaa sidoo kale loo qoondeeyay inay yihiin 'PCR inhibitors'. Marka daacadnimada unugga ay carqaladeyso go'doomin iyo aashitada nucleic-ka ah la sii daayo, isdhexgalka muunadda iyo xalkiisa ku xeeran iyo marxalad adag ayaa dhici karta. Tusaale ahaan, 'qashin-qaadaha' waxay isku xiri karaan hal-ama laba-jibbaaran DNA-da iyada oo loo marayo is-dhexgal aan wadajir ahayn waxayna farageliyaan go'doominta iyo nadiifinta iyagoo yareynaya tirada bartilmaameedyada ee ugu dambeyntii gaadha markabka falcelinta PCR.
Guud ahaan, PCR inhibitors waxay ku jiraan inta badan dareerayaasha jidhka iyo reagents loo isticmaalo baadhitaanada ogaanshaha kiliinikada (urea ee kaadida, hemoglobin iyo heparin ee dhiiga), kaabisyada cuntada (qaybaha organic, glycogen, baruurta, Ca2+ ions) iyo qaybaha deegaanka (phenols). , Biraha culus)

Inhibitors PCR aad u baahsan ayaa laga heli karaa bakteeriyada iyo unugyada eukaryotic, DNA-da aan bartilmaameedka lahayn, makromolecules DNA-ku xidha ee matries nudaha iyo qalabka shaybaadhka sida galoofyada iyo balaastikada. Nadiifinta asiidhyada nucleic-ka ah inta lagu jiro ama ka dib soo saarista ayaa ah habka la door bidayo ee meesha looga saaro PCR-horiyeyaasha.
Maanta, qalabka kala duwan ee soo saarista otomaatiga ah ayaa bedeli kara borotokool badan oo gacanta ah, laakiin 100% soo kabashada iyo/ama nadiifinta bartilmaameedyada weligeed lama gaarin. Kahortagayaasha suurtagalka ah ayaa laga yaabaa inay wali ku jiraan asiidhyada nucleic-ka ah ee la safeeyey ama waxaa laga yaabaa inay mar hore saameyn yeesheen. Xeelado kala duwan ayaa jira si loo dhimo saameynta horjoogayaasha. Doorashada polymerase ku habboon waxay saameyn weyn ku yeelan kartaa dhaqdhaqaaqa xannibaadaha. Hababka kale ee la caddeeyey ee lagu dhimayo ka-hortagga PCR waa kordhinta xoojinta polymerase ama isticmaalka waxyaabaha lagu daro sida BSA.
Joojinta falcelinta PCR waxaa lagu muujin karaa isticmaalka xakamaynta tayada habka gudaha (IPC).
Waa in taxaddar la sameeyaa si looga saaro dhammaan reagen-yaasha iyo xalalka kale ee ku jira xirmada soo saarista, sida ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol iyo phenol, ka soo go'doominta aashitada nucleic iyadoo tallaabo dhaqid ah loo qaaday. Iyadoo ku xiran feejignaantooda, waxaa laga yaabaa inay dhaqaajiyaan ama joojiyaan PCR.